作為固著的生物，植物不能輕易地通過遷移來規(guī)避壓力源。為了評估所經(jīng)歷的非生物和生物脅迫的質(zhì)量和數(shù)量，植物已經(jīng)進(jìn)化出復(fù)雜的信號通路。通常，屬于潛在病原體的分子在植物的質(zhì)膜水平上被識別。識別后，信號會從細(xì)胞外部傳遞到細(xì)胞中，如果可能的話，最終會引發(fā)防御反應(yīng) [1]。在病原體觸發(fā)免疫 (PTI) 中，一種基礎(chǔ)防御反應(yīng)，信號通常在二級信使 Ca 2+的幫助下傳遞。細(xì)胞外空間含有相對高濃度的Ca 2+，尤其是與細(xì)胞質(zhì)中的濃度并列時(shí)。為了對病原體的存在做出反應(yīng)，Ca 2+離子被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中，在轉(zhuǎn)錄因子的幫助下改變細(xì)胞的行為[2]。這種 Ca 2+的輸入與 H +跨質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)合發(fā)生 [3]。質(zhì)子的運(yùn)輸導(dǎo)致細(xì)胞外 pH 值的變化，這很容易量化。pH 值變化是評估植物是否發(fā)生 PTI 反應(yīng)的常用讀數(shù)。

為了快速連續(xù)篩選多種真菌代謝物的免疫活性，需要一個(gè)簡單可靠的系統(tǒng)來測量由 KIT 微結(jié)構(gòu)技術(shù)研究所 (IMT) 與 KIT 植物研究所合作開發(fā)的微流體生物反應(yīng)器 (MBR) 中的 pH 變化。因此，設(shè)計(jì)了從 PreSens pH-1 SMA HP5 到 MBR 中相應(yīng)的傳感器點(diǎn) SP-HP5 的可伸縮但可密封的連接器，并在機(jī)械和生物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了檢查。MBR 是一個(gè)兩室生物反應(yīng)器，用于培養(yǎng)植物細(xì)胞（見圖 1A）?？蓾B透膜將培養(yǎng)和營養(yǎng)流動(dòng)室隔開。它首先由 IMT [4] 的 Tim Finkbeiner 設(shè)計(jì)，然后進(jìn)一步發(fā)展。細(xì)胞可以通過橢圓形腔室兩端的兩個(gè)開口進(jìn)入培養(yǎng)腔室。開口配有 M5 螺紋，以便用合適的螺釘密封它們。MBR 可以通過單向流連接到更多的 MBR。因此，保留在培養(yǎng)室中的細(xì)胞不斷地被供應(yīng)來自先前 MBR 的新鮮培養(yǎng)基和代謝產(chǎn)物，而它們自己的代謝產(chǎn)物被運(yùn)送到后面的 MBR 并帶走廢物?；驹硎峭ㄟ^每個(gè) MBR 培養(yǎng)一種細(xì)胞來剖析細(xì)胞間通訊路徑，以獲得有關(guān)過程和反應(yīng)的信息。在培養(yǎng) BY2 細(xì)胞系的細(xì)胞時(shí)，通過 pH-1 SMA HP5 量化 pH 值 持續(xù)供應(yīng)來自先前 MBR 的新鮮培養(yǎng)基和代謝產(chǎn)物，而它們自己的代謝產(chǎn)物被運(yùn)送到后面的 MBR 并帶走廢物?；驹硎峭ㄟ^每個(gè) MBR 培養(yǎng)一種細(xì)胞來剖析細(xì)胞間通訊路徑，以獲得有關(guān)過程和反應(yīng)的信息。在培養(yǎng) BY2 細(xì)胞系的細(xì)胞時(shí)，通過 pH-1 SMA HP5 量化 pH 值 持續(xù)供應(yīng)來自先前 MBR 的新鮮培養(yǎng)基和代謝產(chǎn)物，而它們自己的代謝產(chǎn)物被運(yùn)送到后面的 MBR 并帶走廢物。基本原理是通過每個(gè) MBR 培養(yǎng)一種細(xì)胞來剖析細(xì)胞間通訊路徑，以獲得有關(guān)過程和反應(yīng)的信息。在培養(yǎng) BY2 細(xì)胞系的細(xì)胞時(shí)，通過 pH-1 SMA HP5 量化 pH 值MBR 培養(yǎng)室中的煙草。可以將待評估免疫活性的物質(zhì)添加到提供給細(xì)胞的培養(yǎng)基中。如果可以觀察到 pH 值的增加，則可以將其解釋為目標(biāo)物質(zhì)具有免疫活性的第一個(gè)跡象。

材料與方法

連接設(shè)置和機(jī)械評估

連接的重要標(biāo)準(zhǔn)是密封生長室，防漏但可拆卸，并提供簡單直觀的操作。此外，我們的目標(biāo)是連接器的建筑高度較小，以使系統(tǒng)適合在顯微鏡下觀察。根據(jù)這些要求，制造了四種連接器設(shè)計(jì)。連接器在 MBR 及其性能中進(jìn)行了測試。光纖的四個(gè)連接器（見圖 2）由聚碳酸酯 (PC) 制成，因?yàn)檫@是 MBR 的外殼材料。兩個(gè)連接器設(shè)計(jì)有盲孔，而另外兩個(gè)連接器在之后鉆孔并密封。對于密封，測試了 PC 箔、簡單膠帶和聚二甲基硅氧烷 (PDMS)。該方法用于確定，如果由于鉆孔工具的劃痕而在盲鉆連接器中受到阻礙的透明度會影響測量的精度。此外，每種類型的一個(gè)連接器都配備了一個(gè)額外的凹槽，以便在發(fā)生泄漏時(shí)容納額外的密封環(huán)作為第二種選擇。首先，使用 Leitz Ergoplan 顯微鏡和 OceanInsight 的 Red Tide USB650 光纖光譜儀，通過測量和比較通過盲孔底部和密封箔的透射率來測試制造的連接器螺釘?shù)耐该鞫? 其次，對制造的連接器螺釘?shù)拿芊饽芰M(jìn)行了測試。使用經(jīng)過測試的連接器密封 MBR，并連接到注射泵（Harvard Apparatus PHD Ultra）。然后，去離子水 (DI-water) 以 2 mL/min 的穩(wěn)定流速泵入 MBR。測試持續(xù) 15 分鐘以確保密封*密封并保持干燥。在對連接器進(jìn)行泄漏測試后，將 pH-1 SMA HP5 連接到 MBR（圖 3 A）。將 pH 傳感器點(diǎn) (SP-HP5) 放置在連接器面向 MBR 內(nèi)部的一側(cè)，并將連接器擰入 MBR 的開口中。最后，將光纖放置在相應(yīng)的連接器中，并使用三種不同的 pH 緩沖溶液（pH 6.00、pH 7.413 和 pH 8.00，Carl Roth）一次一個(gè)泵送通過系統(tǒng)，以評估光纖的測量性能。傳感器連接器。將測量數(shù)據(jù)與使用 Mettler Toledo SevenCompact S220 作為外部 pH 傳感器的緩沖液測量值進(jìn)行比較。

細(xì)胞系和培養(yǎng)設(shè)置

對于 BY2 培養(yǎng)測試，使用普通煙草的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物在 Murashige 和 Skoog 培養(yǎng)基 (MS) 中培養(yǎng)，含有 4.3 g/L Murashige-Skoog 鹽、30 g/L 蔗糖、200 mg/L KH2PO4、100 mg/L 肌醇、1 mg/L 硫胺素和 0.2 mg/ L 2,4-二氯苯氧乙酸。通過將 1.5 mL 的 7 天齡細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到無菌錐形瓶中的 30 mL 新鮮 MS 中，每周對細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行亞培養(yǎng)，并在 26°C 下在設(shè)置為 150 rpm 的軌道搖床上在黑暗中培養(yǎng)。為了在 MBR 內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞，將 750 µL 7 天大的細(xì)胞懸液小心地移入 MBR 的培養(yǎng)室，并使用蠕動(dòng)泵提供新鮮的 MS 培養(yǎng)基（見圖 3B）。流動(dòng)被組織成通過芯片的單向循環(huán)流動(dòng)。蠕動(dòng)泵通過管道以 134 µL/min 的速度運(yùn)行。

殼聚糖引起的 pH 變化的測量

已知?dú)ぞ厶强稍谥参锛?xì)胞中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，并相應(yīng)改變細(xì)胞外 pH 值。在這項(xiàng)工作中，在 MBR 中培養(yǎng)的 BY2 細(xì)胞用 25 µg/mL 殼聚糖（Sigma Aldrich Chemie GmbH，德國）和相應(yīng)的 0.0025% 乙酸溶劑對照進(jìn)行處理。首先，該裝置安裝在如上所述的潔凈工作臺中，管道以圓形方式連接 MBR、泵和 MS 介質(zhì)容器。然后以 134 µL/min 的速度將 MS 介質(zhì)泵入系統(tǒng)并在第一次到達(dá) MBR 時(shí)停止。將 750 µL 7 天大的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到細(xì)胞室中。啟動(dòng)泵，芯片在充滿 MS 的同時(shí)直立，以促進(jìn)剩余氣泡的排出。一旦 MS 介質(zhì)開始從芯片的出口流出，芯片就被安裝到支架中并最終水平放置。在開始 pH 測量之前，將芯片內(nèi)的傳感器平衡 90 分鐘。隨后，測量 pH 值 30 分鐘以計(jì)算基線 pH。然后加入殼聚糖或乙酸并將各自的時(shí)間點(diǎn)定義為0:00。處理后，每 30 秒連續(xù)測量一次 pH 值，持續(xù) 2 小時(shí)。對于每種處理，都創(chuàng)建了一個(gè)生物學(xué)三次。然后加入殼聚糖或乙酸并將各自的時(shí)間點(diǎn)定義為0:00。處理后，每 30 秒連續(xù)測量一次 pH 值，持續(xù) 2 小時(shí)。對于每種處理，都創(chuàng)建了一個(gè)生物學(xué)三次。然后加入殼聚糖或乙酸并將各自的時(shí)間點(diǎn)定義為0:00。處理后，每 30 秒連續(xù)測量一次 pH 值，持續(xù) 2 小時(shí)。對于每種處理，都創(chuàng)建了一個(gè)生物學(xué)三次。

結(jié)果與討論

機(jī)械結(jié)果

帶有用于光纖的鉆孔開口的兩種連接器設(shè)計(jì)覆蓋有 PC 箔、PDMS 和 3M 聚酯膠帶 851（“綠色膠帶"），以在培養(yǎng)室和光纖之間形成防漏邊界MBR外的光纖。在我們的實(shí)驗(yàn)中，PC 箔無法充分粘合，但 3M 聚酯膠帶 851 充分密封了連接器插頭。然而，由于膠帶的綠色和低透光率，這種膠帶密封連接器不能用于 pH 測量。PDMS 密封的鉆孔也密封不漏。此外，盲鉆連接器都充分密封了 MBR。與沒有這些的連接器相比，在密封系統(tǒng)方面沒有明顯的優(yōu)勢，包括額外的凹槽和額外的密封環(huán)。

關(guān)于透明度，PDMS 密封連接器顯示出低的傳輸率，而 PC 箔密封連接器傳輸了大約 95% 的光（見圖 4）。然而，PDMS 的低傳輸可能是由于測量設(shè)置問題造成的。

接下來，測試連接器傳感器設(shè)置的 pH 測量精度。由于制造商的 pH 緩沖值與 S220 傳感器相比是準(zhǔn)確的，因此將測量值與作為參考的給定值進(jìn)行了比較。MBR 中相關(guān)緩沖液的 pH 值以各自的流速測量 3 次，持續(xù) 10 分鐘（流速為 0 mL/min 和 2 mL/min）和 45 分鐘（流速為 0.2 mL/min） . 箱線圖是為三個(gè)測量的組合數(shù)據(jù)庫生成的（圖 5）。確定與給定緩沖值的絕對偏差。對于所有三個(gè) pH 值的所有三個(gè)條件，四分位數(shù)范圍都很小，介于 0.014 pH 到 0.005 pH 之間。除了沒有流動(dòng)循環(huán)的 6-pH 緩沖液中的 pH 值評估之外，中值和平均值幾乎相同。因此，

圖 5：使用不帶密封環(huán)凹槽的盲孔連接器，使用 pH-1 SMA HP5 測量的 pH 值與緩沖液設(shè)定值的絕對偏差。A) 緩沖液：6 pH，B) 緩沖液：7.429 pH，C) 緩沖液：8 pH。

但是，如果將不同的連接器與作為參考系統(tǒng)的玻璃燒杯中的測量值進(jìn)行比較，則 MBR 中的測量值顯示相同緩沖液的測量值明顯高于燒杯中的測量值（圖 6）。這可能是因?yàn)閭鞲衅魇菫椴ＡХ磻?yīng)器設(shè)計(jì)的，而不是通過聚合物進(jìn)行測量。因?yàn)椴荒芨鶕?jù)不同的測量光透射率從使用不同的連接器中導(dǎo)出圖案，所以假設(shè)不同連接器的不同透明度不是測量中偏移的主要原因。

結(jié)論

根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和不同設(shè)計(jì)，我們得出結(jié)論，通過不同連接器設(shè)計(jì)的光傳輸似乎不會顯著影響測量。然而，與通過玻璃燒杯的參考測量值相比，聚合物連接器的測量 pH 值似乎發(fā)生了變化。由于玻璃是傳感器指南中規(guī)定的適當(dāng)反應(yīng)器材料，因此可能需要進(jìn)行特殊校準(zhǔn)以應(yīng)對玻璃中的光折射，從而在使用聚合物時(shí)導(dǎo)致測量值發(fā)生變化。如果這種轉(zhuǎn)變可以得到驗(yàn)證——可能通過更多和不同的設(shè)置測試——并且具有相應(yīng)斑點(diǎn)的 pH-1 SMA HP5 傳感器將適用于測量我們 MBR 中的 pH 值。

在之前的實(shí)驗(yàn)中，我們通過使用使用電極的臺式 pH 計(jì)測量 pH 值，證實(shí) 25 µg/mL 的殼聚糖會導(dǎo)致 BY2 細(xì)胞的細(xì)胞外 pH 值升高。使用相同的處理，這項(xiàng)工作旨在證明 MBR 和 pH-1 SMA HP5 系統(tǒng)的組合可用于觀察與免疫反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞外 pH 值增加。開始處理后，15 分鐘后可觀察到 pH 值顯著增加（見圖 7）。這種延遲可以通過需要將處理過的 MS 泵入 MBR 的時(shí)間來解釋。觀察到的 pH 變化表明該方法可用于篩選植物細(xì)胞上物質(zhì)的免疫活性。通過使用多個(gè)通道和傳感器點(diǎn)，將有可能建立一種高通量篩選方法。此外，我們調(diào)查了 MBR 培養(yǎng)室由于培養(yǎng)室的橢圓形狀而導(dǎo)致的營養(yǎng)梯度的發(fā)展。關(guān)于這個(gè)評估，更大范圍內(nèi)的 pH 值分析，例如，使用 VisiSens 系統(tǒng)，將是有趣的。然而，傳感器箔必須被穿孔以使?fàn)I養(yǎng)流到達(dá)培養(yǎng)室，并且必須建立傳感器箔的安裝過程。